通常来说，免疫杂交技术是基于分子大小分离蛋白的一种技术，蛋白越小，它在凝胶中的迁移速度就越快，但是迁移还会受其他因素的影响，因此，观察到的条带的实际位置与所预期的有可能不同。常见的影响因素包括：

　　1）翻译后修饰，比如磷酸化，糖基化等，这些变化会增加蛋白的大小。
　　2）翻译后剪切，比如很多蛋白在合成的时候是作为前提蛋白合成的，然后剪切形成活性形式，比如天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶前体。
　　3）剪切异构体，同一基因经选择性剪切可能产生不同大小的蛋白。
　　4）相对电荷，氨基酸组成（带电荷与不带电荷）。
　　5）多聚体，比如蛋白二聚化。尽管强相互作用会导致大分子量条带的出现，但是通常还原条件会抑制这种情况发生。

　　众所周知的p53蛋白，其表观分子量是53kDa（这也是该蛋白名字的由来），但是根据氨基酸序列计算得到的分子量却是43kDa。